Seurat包标准流程

秒速五厘米 2024-03-26 15:07 81阅读 0赞

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## 1 安装需要加载的包 ##

install.packages(c('dplyr','patchwork','seurat'))

## 2 加载需要的包 ##

library(dplyr)
    library(Seurat)
    library(patchwork)

## 3 读取数据 ##

pbmc.data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
    #路径是你自己下载数据的位置

## 4 创建Seurat对象 ##

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
    #数据集中测到的少于200个基因的细胞（min.features = 200）和少于3个细胞覆盖的基因（min.cells = 3）被过滤掉
    Pbmc

![f9abd80c4aea7cfb0a121b5ae3635543.png][]

## 5 标准预处理工作流程 ##

以下步骤包括 Seurat 中 scRNA-seq 数据的标准预处理工作流程。包括基于 QC 指标的过滤、数据标准化和归一化，以及检测高变异基因的功能。

QC（质控） 和选择细胞以供进一步分析

Seurat 允许您轻松地探索 QC 指标，并根据任何用户定义的标准过滤细胞。[常用][Link 2]的一些 QC 指标包括

*  在每个细胞中检测到的基因数量。

*  低质量细胞或空液滴通常只有很少的基因

*  细胞双倍或多胞可能表现出异常高的基因计数

*  同样，细胞内检测到的分子总数（与独特的基因密切相关）

*  读取该细胞中的线粒体基因组的百分比

*  低质量/死细胞经常表现出广泛的线粒体污染

*  我们使用[PercentageFeatureSet()][PercentageFeatureSet]函数计算线粒体 QC 指标，该函数计算来自一组功能的计数百分比

*  我们使用从开始的所有基因的集合作为一组线粒体基因MT-

# [[运算符可以为对象元数据添加列。)这是存放QC统计数据的好地方。
    pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

在下面的示例中，我们可视化 QC 指标，并使用这些指标来过滤单元格。

*  我们过滤具有独特特征计数超过 2，500 或小于 200 的细胞

*  我们过滤线粒体计数为>5%的细胞

# 使用violin plot可视化  QC指标，并使用这些指标过滤细胞
    VlnPlot(pbmc,features = c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt"),ncol = 3)

![7ceb919fd658d95dfb833372af2a8fee.png][]

# FeatureScatter 通常用于可视化两个特征之间的关系
    plot1<-FeatureScatter(pbmc,feature1 = "nCount_RNA",feature2 = "percent.mt")
    plot2<-FeatureScatter(pbmc,feature1 = "nCount_RNA",feature2 = "nFeature_RNA")
    plot1+plot2

![e73004ebcd69b7fc0a6c5c821ef896d7.png][]

# 过滤具有2500或少于200的独特特征计数的细胞，过滤线粒体计数>5%的细胞
    pbmc<-subset(pbmc,subset=nFeature_RNA>200 & nFeature_RNA<2500 & percent.mt<5)

## **6 规范化数据** ##

从数据集中删除不需要的单元格后，下一步是规范化数据。默认情况下，我们采用全局缩放归一化方法“LogNormalize”，该方法将每个单元格的特征表达式测量值归一化为总表达式，将其乘以比例因子（默认为 10，000），并对结果进行对数转换。规范化值存储在 中。pbmc\[\["RNA"\]\]@data

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

--------------------

![e40e0e8c8a9246f3e608007bf83ed1a9.png][]

为清楚起见，在前面的代码行（以及将来的命令）中，我们为函数调用中的某些参数提供了默认值。但是，这不是必需的，可以使用以下方法实现相同的行为：

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

## **7特征选择** ##

默认情况下，每个数据集返回 2，000 个特征。这些将用于下游分析，如PCA。[FindVariableFeatures()][FindVariableFeatures]

pbmc<-FindVariableFeatures(pbmc,selection.method = "vst",nfeatures = 2000)

![d2a2bc6e6d1980e98e248e23b08b6607.png][]

# 确定高表达的前十个基因
    top10<-head(VariableFeatures(pbmc),10)
    plot1<-VariableFeaturePlot(pbmc)
    plot2<-LabelPoints(plot = plot1,points = top10,repel = TRUE)
    plot1+plot2

![099e8ebd18008f64fc7d0bf590be1540.png][]

## **8缩放数据** ##

*  移动每个基因的表达，使跨细胞的平均表达为 0

*  缩放每个基因的表达，使细胞之间的方差为 1

这一步在下游分析中给予同等的权重，因此高表达基因不会占主导地位

*  其结果存储在pbmc\[\["RNA"\]\]@scale.data

all.genes<-rownames(pbmc)
    pbmc<-ScaleData(pbmc,features = all.genes)

## 9线性降维 ##

pbmc<-RunPCA(pbmc,features = VariableFeatures(object=pbmc))
    print(pbmc[["pca"]],dims = 1:5,nfeatures = 5)

![ce4232290f79d734993f999cfb39433e.png][]

# Seurat提供可视化细胞和定义PCA,包括功能的几种有用的方法ViziDimReduction(),DimPlot()和DimHeatmap()
    VizDimLoadings(pbmc,dims = 1:2,reduction = "pca")

![d2e7712ffb4fd39f734b6653e18473fd.png][]

DimPlot(pbmc,reduction = "pca")

![2cbcbf8fe369d685a14a9300c46634ed.png][]

DimHeatmap(pbmc,dims = 1,cells = 500,balanced = TRUE)

![3c005ca61419692208457a5f89bd5c1e.png][]

DimHeatmap(pbmc,dims = 1:15,cells=500,balanced = TRUE)

![cc16038c1079512b6a8780eb558b07f4.png][]

## 10 确定数据集的维度 ##

Seurat 根据 PCA 分数对单元单元进行聚类，每台 PC 基本上代表一个"元结构"，该"元结构"将信息组合在相关功能集中。我们随机排列数据的子集（默认情况下为 1%）并重新运行 PCA，构建功能分数的"空分布"，并重复此过程。我们确定"重要"PC。

pbmc<-JackStraw(pbmc,num.replicate = 100)
    pbmc<-ScoreJackStraw(pbmc,dims = 1:20)

# 可视化处理 JackStrawPlot()功能提供了一个可视化工具，用于将每个 PC 的 p 值分布与统一分布（虚线）进行比较。"重要"PC 将显示在虚线上方。
    JackStrawPlot(pbmc,dims = 1:15)

![575aaf4459c83844d41274c386d1935c.png][]

[ElbowPlot()]根据每个（函数）解释的方差百分比对原则组件进行排名。在此示例中，我们可以观察到 PC9-10 周围的"肘部"，表明大多数真实信号在前 10 个 PC 中被捕获。
    ElbowPlot(pbmc)

![87028201423648e6368cb76200d2a9e0.png][]

## 11聚类细胞 ##

# 建立KNN图，并基于其局部领域中的共享重叠细化任意两个单元之间的边权重
    pbmc<-FindNeighbors(pbmc,dims = 1:10)
    #对细胞进行聚类，应用模块化优化技术，Louvain算法（默认）或SLM
    # 以迭代方式将细胞分组在一起，目标是优化标准模块化函数
    pbmc<-FindClusters(pbmc,resolution = 0.5)

![1cac1efa90e0eeac719ea27ccd702033.png][]

head(Idents(pbmc),5)

![12d72fd286d42c8795be1385dc429df8.png][]

## 12 运行非线性降维（UMAP/tSNE） ##

pbmc<-RunUMAP(pbmc,dims = 1:10)
    DimPlot(pbmc,reduction = "umap")

![ed12caec73abf6c04078e0a281480394.png][]

## 13 寻找差异表达的特征（簇生物标志物） ##

# findmarkers为所有集群自动执行此过程，也可以测试集群组之间的对比，或针对所有单元格进行测试
    # 默认情况下，ident.1与所有其他细胞相比，他识别单个簇的阳性和阴性标记。
    # min.pct参数要求在两组细胞中的任何一组中以最小百分比检测到一个特征
    # 而 thresh.test 参数要求一个特征在两组之间差异表达（平均）一定量
    # 寻找cluster2的所有markers
    cluster2.markers<-FindMarkers(pbmc,ident.1 = 2,min.pct = 0.25)
    head(cluster2.markers,n=5)

![d61445c984303e17ebd85cceaa069406.png][]

# 寻找cluster5中与cluster0和cluster3n不同的所有markers
    cluster5.markers<-FindMarkers(pbmc,ident.1 = 5,ident.2=c(0,3),min.pct = 0.25)
    head(cluster5.markers,n=5)

![25acdd6a2e2eb46f3bac3fc1a4b65dba.png][]

# 找出每个细胞簇的标记物，与所有剩余的细胞进行比较，只报告阳性细胞 
    pbmc.markers<-FindAllMarkers(pbmc,only.pos = TRUE,min.pct = 0.25,logfc.threshold =0.25 )
    pbmc.markers %>%
      group_by(cluster) %>%
      slice_max(n=2,order_by = avg_log2FC)

![52f065b8788ae1b994bc61a915022014.png][]

# 还有用于可视化标记表达的工具，Vlnplot(显示跨集群的表达概率分布)和FeaturePlot()(在tSNE或PCA图上可视化特征表达)是最常用的可视化，建议探索RidgePlot(),CellScatter（），和DotPlot()作为查看数据集的其他方法
    VlnPlot(pbmc,features = c("MS4A1","CD79A"))

![330cb8d52e103a120c4ed2e7ee3b5d07.png][]

# 可以绘制行数据
    VlnPlot(pbmc,features = c("NKG7","PF4"),slot = "counts",log = TRUE)

![5f4e5436d84de7b776bef65de7581f79.png][]

FeaturePlot(pbmc,features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP",
                                  "CD8A"))

![a1eb82a9f0cc45cfc2b7f1857b97f2e4.png][]

#DoHeatmap()为给定的细胞和特征生成一个表达热图。在这种情况下，我们为每个集群绘制前 20 个标记（或所有标记，如果小于 20）。
    pbmc.markers%>%
      group_by(cluster)%>%
      top_n(n=10,wt=avg_log2FC)->top10
    DoHeatmap(pbmc,features = top10$gene)+NoLegend()

![8935ffbec3f57bba11f9ffd6fb3171ff.png][]

## 14将细胞类型标识分配给集群 ##

![a6672b37fc351a101ae8261bc52598e2.png][]

new.cluster.ids<-c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono",
                       "NK", "DC", "Platelet")
    names(new.cluster.ids)<-levels(pbmc)
    pbmc<-RenameIdents(pbmc,new.cluster.ids)
    DimPlot(pbmc,reduction = "umap",label = TRUE,pt.size = 0.5)+NoLegend()

![2ee5a8e97e4bf83eed2ea58c386dd279.png][]

saveRDS(pbmc,file = "./pbmc3k_final.rds")

[Link 1]: https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
[f9abd80c4aea7cfb0a121b5ae3635543.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/3968c3291c3b425d8f13d72265a65a4d.png
[Link 2]: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4758103/
[PercentageFeatureSet]: https://satijalab.org/seurat/reference/percentagefeatureset
[7ceb919fd658d95dfb833372af2a8fee.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/a5c23f082640481096d3097a54b04453.png
[e73004ebcd69b7fc0a6c5c821ef896d7.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/ff3b74c9bd9a4502a7f57d8f3fcbf4b4.png
[e40e0e8c8a9246f3e608007bf83ed1a9.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/2cfb73c10b3648a2bb327c931345e0f2.png
[FindVariableFeatures]: https://satijalab.org/seurat/reference/FindVariableFeatures.html
[d2a2bc6e6d1980e98e248e23b08b6607.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/9b6e0e24b18445859b25ca7c98ad6e77.png
[099e8ebd18008f64fc7d0bf590be1540.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/1ad868abede24ab988dad55b25c81759.png
[ce4232290f79d734993f999cfb39433e.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/a55539df86504454ab256bca6e7b570b.png
[d2e7712ffb4fd39f734b6653e18473fd.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/8fa5e1bec19b4d7b8a288d0ea58b0e9a.png
[2cbcbf8fe369d685a14a9300c46634ed.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/9e0b28d825124fa08e84c2248a6ff66e.png
[3c005ca61419692208457a5f89bd5c1e.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/bfcb535f44ff4194a2afb0e5f340e6d2.png
[cc16038c1079512b6a8780eb558b07f4.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/2c572b88da88481ea04d4bc198b059db.png
[575aaf4459c83844d41274c386d1935c.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/40d480c8f4cb4dd4830d736c8f8676cc.png
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[1cac1efa90e0eeac719ea27ccd702033.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/279e278ddf9640359fc3a3f5df6b8e03.png
[12d72fd286d42c8795be1385dc429df8.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/97918ecc76404c3597be6937a8cb9942.png
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[25acdd6a2e2eb46f3bac3fc1a4b65dba.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/371637aa0c8444dca42263c9e72d9414.png
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[330cb8d52e103a120c4ed2e7ee3b5d07.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/cff1620b8736491584ecc049bf733d36.png
[5f4e5436d84de7b776bef65de7581f79.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/007a1457d9cf4d589d4920adcaa31f63.png
[a1eb82a9f0cc45cfc2b7f1857b97f2e4.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/59db37eff1a84c79a18653eb5334bd48.png
[8935ffbec3f57bba11f9ffd6fb3171ff.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/3c6b55011478420587d8455e523af325.png
[a6672b37fc351a101ae8261bc52598e2.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/0a4c05fbd97f41219cb023ccc9c94824.png
[2ee5a8e97e4bf83eed2ea58c386dd279.png]: https://image.dandelioncloud.cn/pgy_files/images/2024/03/26/6898cced44f0490caeccee7668fd7b5b.png